植物学综合实验

王东辉授课教师

北京大学

博士

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课程简介

《植物学综合实验》是针对植物学专业高年级本科生开设的实用型专业技术培训课，本课程并不仅仅适用于植物学专业的学生，对其他专业的学生来说也是非常有益的技术培训课，本课程主要分数个大的主题技术：切片实验技术；激素或者蛋白免疫组化（IHC）或者免疫荧光（Immunofluorescence）定位技术；原位杂交实验技术等。

课程大纲

1、切片实验技术

石蜡切片，组织学常规制片中最为广泛应用的方法，不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中，它是最基本、最经典的实验技术。

石蜡切片实验包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。

第一周：材料的取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋过程

第二周：切片机使用、包埋材料的修块，切片与贴片、烘片

第三周：石蜡切片的脱蜡、复水、染色

第四周：石蜡切片的封片、显微观察

2、激素或者蛋白免疫组化（IHC）或者免疫荧光（Immunofluorescence）定位技术

免疫组化（IHC）或者免疫荧光（Immunofluorescence）利用抗体检测组织切片中蛋白质和其他抗原的定位，抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，IHC 可以提供完整组织中蛋白定位的宝贵信息，是一种广泛应用的技术。多重免疫组织化学/免疫荧光（Multiplex Immunohistochemistry/Immunofluorescence，mIHC/IF）已成为一种非常有前景的技术。mIHC/IF提供高通量的多重染色和标准化的定量分析，并且重复性好、时间成本效益高。这项技术在植物发育学、转化医学等研究中都具有强大的应用潜力。

免疫组化包括石蜡切片的所有步骤，在石蜡切片的基础上进行免疫学反应，后续步骤包括切片脱蜡复水、封闭反应、一抗结合、二抗结合、显色反应等步骤。

第五周：石蜡切片制作

第六周：石蜡切片的脱蜡复水，抗体或者激素的免疫反应

第七周：石蜡切片的二抗结合，洗涤、显色反应

第八周：显色反应后的洗涤及显微观察

3、原位杂交实验技术

原位杂交（Insitu hybridization ，ISH）mRNA检测，顾名思义，是一种定位和检测特定的mRNA序列在组织的方法，是发育生物学研究的一种基本的实验技术。原位杂交的价值和贡献在于通过标记的探针和靶基因反应的专一性（核酸杂交配对），揭示了组织内目标核酸精确定位，可以展现出在细胞水平甚至亚细胞水平下基因的时空表达情况。最近数十年在最初的放射性原位杂交技术的基础上发展出各种非放射性标记的原位杂交技术被广泛的应用于各个物种的基因表达检测，迄今为止，ISH仍然是基因表达分析的理想选择。

原位杂交包括石蜡切片的所有步骤，在石蜡切片的基础上进行原位杂交反应，后续步骤包括探针制备、切片脱蜡复水、探针结合、二抗结合、显色反应等步骤。

第九周：探针的模板准备，探针标记、探针检测

第十周：石蜡切片及其脱蜡复水、切片封闭、探针杂交反应

第十一周：二抗结合，洗涤、显色反应实验

第十二周：显色反应后的洗涤及显微观察

4、徒手切片的蛋白定位实验技术

徒手切片操作简单，与石蜡切片方法相比不需要进行脱水、浸蜡、包埋等过程，从而大大缩短实验操作流程，减少耗时，且仅在透明和染色过程中需用试剂处理材料，从而降低实验成本。另外，徒手切片还不需要切片机等贵重仪器，作为对于解剖学突变体的预筛选过程，可以很大程度上减少工作量，提高筛选速率，降低研究成本。还可以作为对需要做石蜡切片观察的实验材料进行初选，及对不需要进行精细观察组织结构的实验研究提供简便方法

第十三周：徒手切片的材料固定及溶液配制

第十四周：徒手切片及前处理

第十五周：切片的脱水、透明，免疫反应

第十六周：切片的二抗反应及显色观察

课程说明

参考资料

1. 王东辉. 植物发育生物学常用实验技术. 北京：北京大学出版社，2017.

2. 王东辉. 植物学专业研究生实验教学模式的创新与实践. 高校生物学教学研究(电子版).2017, 7(3):43-47.

3. 王东辉，王玄之，王梓豪，葛丽丽. 本科生植物学综合实验课程改革与实践. 高校生物学教学研究(电子版)，2021,11(5):33-36.

拓展阅读

1. 张书敏，刘红云，程金金，冯丹忆，刘征，快速徒手切片法观察谷子和水稻叶片显微结构，《基因组学与应用生物学》 , 2015, 34(7):1527-1530.

2. Bai S L，Peng Y B，Cui J X，etal. Developmental analyses reveal early arrests of the spore-bearing parts ofreproductive organs in unisexual flowers of cucumber (Cucumis sativus L.)Planta, 2004, 220:230-240.

3. 徐云远，种康，许智宏，谭克辉. 原位杂交实用技术. 植物学通报, 2002, 19(2):234-238.

4. Gu HT, Wang DH, Li X, et al.Characterization of an ethylene inducible, calcium dependent nuclease that isdifferentially expressed in cucumber flower development. New Phytologist 2011,192:590-600.

5. Peng YB, Zou C, Wang DH, et al.Preferential localization of abscisic acid in primordial and nursing cells ofreproductive organs of Arabidopsis and cucumber[J]. New Phytology 2006,170:459-466.

其他

主讲教师

王东辉 博士

王东辉，博士，从事植物学实验教学和研究工作，独立承担3门研究生课程，2门本科生课程，出版教材1部，译著1部，发表专业SCI论文40多篇，作为第一发明人授权专利20多项，计算机软件著作权1份。先后承担和参与近20项国家自然科学基金、科技部973、863、国家重点研发计划、农业部转基因专项、教育部协同育人基金等项目。获得过2次优秀班主任二等奖，2次北京大学创新教与学应用大赛三等奖，北京大学教改论文三等奖。

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